اثر سویه‌های مختلف (Agrobacterium rhizogenes) در القای ریشه مویین در گیاه دارویی گل راعی(Hypericum perforatum)

چکیده
سابقه و هدف:
گل راعی (Hypericum perforatum) ازجمله گیاهان در معرض خطر انقراض است که به‌دلیل وجود متابولیت‌های ثانویه مختلف در صنعت داروسازی اهمیت فراوانی دارد. امروزه استخراج و تولید اقتصادی اغلب متابولیت‌های ثانویه از طریق جمع‌آوری گیاهان دارویی از رویشگاه طبیعی عمدتاً با مشکلات فراوانی همراه است و استفاده از فناوری کشت ریشه‌های مویین رهیافتی مؤثر در تولید تجاری متابولیت‌های ارزشمند دارویی در شرایط آزمایشگاهی است. کشت ریشه مویین با استفاده از Agrobacterium rhizogenes یکی از روش‌های کاربردی برای مطالعه مسیر بیوسنتز متابولیت‌های ثانویه می‌باشد. پژوهش‌های مختلف نشان داده است که از میان ژن‌های rolA، rolB، rolC و rolD موجود در A. rhizogenes، ژن rolB نقش اصلی در القای ریشه مویین دارد و بقیه ژن‌ها نقش کمتری در این موضوع ایفا می‌کنند. هدف از این پژوهش، تأثیر تلقیح سویه‌های مختلف A. rhizogenes با ریزنمونه‌های برگ، ساقه و ریشه در القای ریشه‌های مویین در گیاه دارویی گل‌راعی بود.
ﻣﻮاد و روشﻫﺎ:
بذر گل‌راعی از مؤسسه تحقیقات جنگل‌ها و مراتع کشور در تهران تهیه شد. به‌منظور بررسی تأثیر سویه‌های آگروباکتریوم در القای ریشه‌های مویین،‌ آزمایش فاکتوریل با فاکتور A نوع ریزنمونه‌های برگ، ساقه و ریشه گل راعی و فاکتور B پنج سویه A.rhizogenes شامل (1724، ATCC، Mus، A4 و (R1000 در قالب طرح کاملاً تصادفی با سه تکرار در بخش زیست‌فناوری مؤسسه در سال 1401 انجام شد. گیاهچه‌های 15 روزه گل راعی در محیط ‌کشت MS کامل دو مرتبه واکشت شدند و بعد توسط پنج سویه‌ A. rhizogenes تلقیح و به محیط کشت برای القای ریشه مویین منتقل شدند. درنهایت ویژگی‌های مورفولوژیکی ازجمله طول ریشه اصلی و فرعی، تعداد ریشه‌های مویین، وزن تر و خشک و درصد القای ریشه مویین به‌مدت دو ماه ارزیابی گردید. با توجه به اینکه در A. rhizogenes، ژن rolB نقش اصلی در القای ریشه مویین دارد، به همین دلیل برای تأیید حضور ژن rolB در سویه‌های آگروباکتریوم، DNA ژنومی از ریشه‌های‌ موئین به‌روش CTAB استخراج شد. چاهک‌های حاوی ریشه‌های‌موئین حاصل از ریزنمونه تلقیح شده به‌عنوان کنترل مثبت و ریشه‌های تلقیح نشده نیز به‌عنوان نمونه‌های کنترل منفی استفاده شد. با استفاده از الکتروفورز، قطعات با طول‌های مختلف DNA از یکدیگر تشخیص داده شدند. داده‌های مورفولوژی ریشه‌های مویین تجزیه واریانس شدند. مقایسه میانگین‌ها با استفاده آزمون چند دامنه‌ای دانکن انجام شد. از نرم‌افزار SPSS برای تجزیه آماری و از نرم‌افزار Excel برای رسم نمودارها استفاده گردید.
 
نتایج
در مقایسه بین ریزنمونه‌ها، بیشترین درصد القای ریشه مویین (44/24 درصد)، بیشترین وزن تر (54/7 گرم) و وزن خشک (46/4 گرم) در ریزنمونه ‌برگ تلقیح شده با سویه باکتریایی R1000 به‌دست آمد که به‌طور معنی‌داری از سایر سویه‌های A. rhizogenes و ریزنمونه شاهد بیشتر بود. کمترین میزان درصد القای ریشه‌ مویین (77/17 درصد) در سویه‌ باکتری 1724 در ریزنمونه برگ و کمترین درصد القای ریشه مویین (88/8 درصد) در سویه باکتری ATCC در ریزنمونه ساقه مشاهده شد. در ریز‌نمونه‌های ریشه به‌جز سویه‌های باکتریایی A4 و Mus، سایر سویه‌های باکتری موفق به القای ریشه مویین نشدند. در نهایت لاین‌های ریشه مویین تراریخته با حضور ژن rolB با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن rolB تأیید شدند.
نتیجه‌گیری
نتایج این پژوهش نشان داد که نوع ریزنمونه، نوع سویه‌های A. rhizogenes و نوع محیط کشت در تولید یا عدم تولید ریشه‌های مویین تراریخت در گل‌راعی موثر هستند. در ریزنمونه‌های برگ و ساقه، سویه باکتریایی R1000 از لحاظ تولید ریشه‌های مویین، درصد القای ریشه مویین و افزایش وزن تر و خشک نسبت به سایر سویه ها برتری داشت. در ریزنمونه ریشه، سویه باکتریایی A4 بیشترین تأثیر را در القای ریشه مویین و درصد القای ریشه مویین داشت. در نهایت با توجه به برتری سویه باکتریایی R1000 در ریزنمونه‌ برگ نسبت به سایر سویه‌های باکتریایی برای تولید ریشه‌های مویین در گیاه گل‌راعی توصیه گردید