شناسایی بررسی بیان برخی از microRNAهای حفاظت شده دخیل در مسیر بیوسنتز ویتانولیدها در پنیرباد (Withania somnifera)

نوع مقاله : مقاله علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه تهران

2 گروه زراعت و اصلاح نباتات، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، دانشگاه تهران

3 علوم پزشکی البرز

4 پژوهشکده کشاورزی هسته ای، پژوهشگاه علوم و فنون هسته ای، سازمان انرژی اتمی ایران

10.22092/ijrfpbgr.2023.362665.1441

چکیده

سابقه و هدف: پنیرباد (Withania somnifera) متعلق به خانواده سیب‌زمینی، به صورت یک درختچه کوچک همیشه سبز با ریشه­های غده­ای بزرگ است و در مناطق گرمسیری و نیمه‌گرمسیری وجود دارد. ترکیبات اصلی پنیرباد، ویتانولیدها هستند که شامل ویتافرینA، ویتانولیدD، ویتانولیدA و ویتانون­ها می‌باشند. ویتافرین A و ویتانون­ها بیشتر در برگ­های پنیرباد وجود دارند، در حالی‌ که ویتانولید  Aعمدتاً در ریشه تولید می­شود. بیوسنتز این متابولیت‌ها به ژن­های فارنسیل پیروفسفات (FPP)، سیکلوآرتنول­سنتاز (CAS)، استرول­متیل ترانسفراز (SMT1) و ‌هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMGR)، مرتبط با مسیرهای متابولیک مربوط بستگی دارد و RNAهای غیرکدکننده مانند miRNA­ها در تنظیم  بیان این ژن­ها و آنزیم­ها نقش دارند. ژن­های miRNA­ها، RNAهای کوچک با طول 18- 24 نوکلئوتید هستند که هیچ پروتئینی کد نمی­کنند و بروز ژن را در گیاهان و حیوانات تنظیم می­کنند. این گروه از RNAهای غیر­رمز کننده نقش مهمی در تنظیم بیان ژن پس از رونویسی ایفا می­کنند و به‌عنوان تنظیم‌کننده­های منفی بیان ژن در یوکاریوت­ها فعالیت دارند. این تحقیق با هدف شناسایی و بررسی بیان برخی miRNA‌های حفاظت شده دخیل در بیوسنتز ویتانولیدها در گیاه پنیرباد اجرا گردید.
مواد و روش‌ها: در این پژوهش، برای انجام آنالیز HPLC از دستگاه کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا متصل به آشکارساز ELSD، مدل C-650 استفاده شد. به منظور شناسایی miRNA های حفاظت شده در گیاه پنیرباد از داده­های  RNA-seqمبتنی بر همولوژی توسط نرم‌افزار C-mii از BLASTn با معیارهای تا چهار عدم تطابق وE- value < 10  استفاده شد. ساختار ثانویه miRNAهای متمایز به وسیله نرم‌افزار Mfold تعیین شد. ژن‌های هدف miRNAهای نامزد با استفاده از psRNATarget بر اساس پارامترهای زیر شامل: E-value < 1.0E-5، تعداد جایگاه­­های مورد هدف برابر2، محدوده نداشتن بازهای مرکزی بین 10-11 نوکلئوتید، بیشترین عدم تشابه برابر 2 و بدون هیچ گونه فاصله انتخاب گردیدند و برای پی بردن به عملکرد ژن­های هدف از ابزارBLASTx  علیه پایگاه داده پروتئینی استفاده شد. در مرحله گلدهی نمونه‌برداری از دو بافت برگ و ریشه سه ژنوتیپ W1 (7629245)،W3  (7629241) و W4 (7629244) با سه تکرار تکنیکی و سه تکرار بیولوژیکی انجام گردید. از Real-time PCR برای ارزیابی بیان miRNA5021 و ژن هدف آن SMT1 و miRNA5140 استفاده شد و تجزیه داده­های حاصل از بیان با استفاده از روش  CTΔΔ -2 انجام شد.  
یافته‌ها: با توجه به تجزیه‌های آماری داده­های حاصل از HPLC، بین مقدار ویتافرین­آ در سه ژنوتیپ (W1، W3 و W 4) از لحاظ آماری اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد. در بین بافت­های مورد مطالعه بیشترین میزان مربوط به برگ W3 و کمترین به ریشه W1 اختصاص داده شده است. برای شناسایی miRNAها ساختار دوم توالی­ها با سرور mfold پیش­بینی شد. حداقل انرژی آزاد پیچش (MFE) از 15- تا 4/130- kcal.mol متفاوت بود و میانگین آن 98/42- kcal.mol محاسبه گردید. نتایج حاصل از روش RT-qPCR نشان داد که میزان بیان نسبی miR5021 در ریشه W1، W3 و W4 نسبت به شاهد (بافت برگ W1)، 16/1، 37/1 و 17/1 به ترتیب افزایش بیان و در برگ W3 و W4 به ترتیب 1/3 و 7/3 برابر کاهش بیان مشاهده شد. الگوی بیان برای ژن SMT1 در سه ژنوتیپ W. somnifera برای ریشه W1،  W3و W4 به ترتیب 7/7، 8/2 و 4 برابر کاهش و در برگ W3 و W4 به ترتیب 48/2 و 82/1 برابر افزایش بیان نسبت به  شاهد مشاهده شد. همچنین بیان نسبی miR5140 در برگ W3، 57/1 و برای W4 بدون تغییر و در ریشه,WI  W3 و  W4نسبت به شاهد به ترتیب هفت، نه و سه برابر کاهش بیان دیده شد که طبق انالیزهای آماری برای miRNA5021 و miRNA5140 در بین  سه ژنوتیپ­ برای هر یک از این ژن­ها اختلاف معنی‌داری وجود ندارد.
نتیجه­‌گیری: در مجموع با توجه به نقش تنظیمی miRNAهای شناسایی شده در این مطالعه، می­توان از این ژن­ها در شناسایی بهتر و دقیق­تر مسیر بیوسنتز ویتانولیدها استفاده کرد.

کلیدواژه‌ها

موضوعات

مراجع

  • Anjali, N., Nadiya, F., Thomas, J., and Sabu, K. 2019. Identification and characterization of drought responsive microRNAs and their target genes in cardamom (Elettaria cardamomum Maton). Plant Growth Regulation 87, 201-216.
  • Bavelloni, A., Ramazzotti, G., Poli, A., Piazzi, M., Focaccia, E., Blalock, W., and Faenza, I. 2017. MiRNA-210: a current overview. Anticancer research 37, 6511-6521.

Bhat, W. W., Lattoo, S. K., Razdan, S., Dhar, N., Rana, S., Dhar, R. S., Khan, S., and Vishwakarma, R. A. 2012. Molecular cloning, bacterial expression

  • genes in Papaver somniferum. Iranian Journal of Field Crop Science 48. (In Persian)
  • Kaur, K., Dolker, D., Behera, S., and Pati, P. K. 2022. Critical factors influencing in vitro propagation and modulation of important secondary metabolites in Withania somnifera (L.) dunal. Plant Cell, Tissue, and Organ Culture (PCTOC) 149, 41-60.
  • Kaushik, N. 2020. HPLC analysis of Withania somnifera (Linn.) Dunal reveals two chemotypes in Indian germplasm and seasonal and genetic variability in Withaferin A-Content. BioRxiv, 2020.07. 31.231316.
  • Kiani, H. S., Sabokdast Noudehi, M., Naghavi, M. R., Shokrpoor, M., & Yazdanfar, N. 2023. Identification of conserved miRNAs and their target genes in the damask rose (Rosa damascena). Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 30(2), 175-191. (In Persian)
  • Kuruvilla, L., Sathik, M., Luke, L. P., and Thomas, M. 2019. Identification and validation of drought-responsive microRNAs from Hevea brasiliensis. Acta Physiologiae Plantarum 41, 1-15.
  • Lopresti, A. L., Smith, S. J., Malvi, H., and Kodgule, R. 2019. An investigation into the stress-relieving and pharmacological actions of an ashwagandha (Withania somnifera) extract: A randomized, double-blind, placebo-controlled study. Medicine 98.
  • Lukan, T., Veillet, F., Križnik, M., Coll, A., Mahkovec Povalej, T., Pogačar, K., Stare, K., Chauvin, L., Chauvin, J.-E., and Gruden, K. 2022. CRISPR/Cas9-mediated fine-tuning of miRNA expression in tetraploid potato. Horticulture research 9.
  • Mehmood, F., Shahzadi, I., Ahmed, I., Waheed, M. T., and Mirza, B. 2020. Characterization of Withania somnifera chloroplast genome and its comparison with other selected species of Solanaceae. Genomics 112, 1522-1530.
  • Naghavi, M. R., & Karimi, A. A. 2018. Identification of miRNAs and their target genes in red clover (Trifolium pretense). Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 26(2), 156-164.‏ (In Persian)

Noormohammadi, N., Ismaili, A., Sobhani Najafabadi, A., & Nazarian-Firouzabadi, F. 2022. Identification of conserved miRNAs of Hypericum perforatum using next-generation sequencing (NGS) data. Iranian Journal of Rangelands and Forests Plant Breeding and Genetic Research, 30(1), 72-85 (In Persian) 

  • and promoter analysis of squalene synthase from Withania somnifera (L.) Dunal. Gene 499, 25-36.
  • Çakır, Ö., Arıkan, B., Karpuz, B., and Turgut-Kara, N. 2021. Expression analysis of miRNAs and their targets related to salt stress in Solanum lycopersicum H-2274. Biotechnology & Biotechnological Equipment 35, 275-282.‏
  • Chaharbonicheh Faraji, M., Naghavi, M. R., Sabokdast Nodehi, M., & Nasiri, J. 2021. Identification of conserved microRNAs and their targets in Cichorium intybus and Cichorium endivia.Iranian Journal of Field Crop Science, 52(3), 1-10
  • Choudhary, S., Kaur, I. P., and Malik, J. 2019. Development and validation of a novel, rapid gradient HPLC method for simultaneous estimation of bioactive marker compounds in a mixture of Convolvulus pluricaulis, Withania somnifera and Bacopa monnieri Journal of Chromatographic Science 57, 920-930.
  • Dar, N. J., Hamid, A., and Ahmad, M. 2015. Pharmacologic overview of Withania somnifera, the Indian Ginseng. Cellular and molecular life sciences 72, 4445-4460.
  • Divisha, R., Ranganathan, V., Vijayakaran, K., Elamaran, A., and Senthil, K. 2018. Quantifying phytophenols in Andrographis paniculata and Withania somnifera leaf extract. J Pharam 7, 477-479.
  • Gebert, L. F., and MacRae, I. J. 2019. Regulation of microRNA function in animals. Nature reviews Molecular cell biology 20, 21-37.
  • Gupta, , Goel, R., Pathak, S., Srivastava, A., Singh, S. P., Sangwan, R. S., Asif, M. H., and Trivedi, P. K. 2013. De novo assembly, functional annotation and comparative analysis of Withania somnifera leaf and root transcriptomes to identify putative genes involved in the withanolides biosynthesis. PLoS One 8, e62714.
  • Ha, J. W., Yu, J. S., Lee, B. S., Kang, D.-M., Ahn, M.-J., Kim, J. K., and Kim, K. H. 2022. Structural Characterization of Withanolide Glycosides from the Roots of Withania somnifera and Their Potential Biological Activities. Plants 11, 767.
  • Karimi, A., Naghavi, M., Peyghambari, S., Sobhani, A., and Rasoulnia, A. 2022. Identification of miRNAs and Their Target Genes in Taraxacum spp. Journal of Agricultural Science and Technology 24, 1457-1471. (In Persian)

Karimi, A. A., Naghavi, M., and Nasiri, J. 2018. Identification of miRNAs and their related target

  • Mentha spp. Computational Biology and Chemistry 64, 154-162.
  • Singh, P., Guleri, R., Singh, V., Kaur, G., Kataria, H., Singh, B., Kaur, G., Kaul, S. C., Wadhwa, R., and Pati, P. K. 2015. Biotechnological interventions in Withania somnifera (L.) Dunal. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 31, 1-20.
  • Siriwardane, A., Dharmadasa, R., and Samarasinghe, K. 2013. Distribution of withaferin A, an anticancer potential agent, in different parts of two varieties of Withania somnifera (L.) Dunal. grown in Sri Lanka. Pak J Biol Sci 16, 141-144.
  • Smith-Unna, R., Boursnell, C., Patro, R., Hibberd, J. M., and Kelly, S. 2016. TransRate: reference-free quality assessment of de novo transcriptome assemblies. Genome research 26, 1134-1144.
  • Srivastava, S., Sanchita, Singh, R., Srivastava, G., and Sharma, A. 2018. C omparative Study of Withanolide Biosynthesis-Related miRNAs in Root and Leaf Tissues of Withania somnifera. Applied Biochemistry and Biotechnology 185, 1145-1159.
  • Srivastava, S., Singh, N., Srivastava, G., and Sharma, A. 2017. MiRNA mediated gene regulatory network analysis of Cichorium intybus (chicory). Agri Gene 3, 37-45.
  • Tripathi, N., Shrivastava, D., Mir, B. A., Kumar, S., Govil, S., Vahedi, M., and Bisen, P. S. 2018. Metabolomic and biotechnological approaches to determine therapeutic potential of Withania somnifera (L.) Dunal: A review. Phytomedicine 50, 127-136.
  • Varkonyi-Gasic, E., Wu, R., Wood, M., Walton, E. F., and Hellens, R. P. 2007. Protocol: a highly sensitive RT-PCR method for detection and quantification of microRNAs. Plant methods 3, 1-12.
  • Wang, Y., Dai, J., Chen, R., Song, C., Wei, P., Cai, Y., Wang, Y., and Han, B. 2021. miRNA-based drought regulation in the important medicinal plant Dendrobium huoshanense. Journal of Plant Growth Regulation, 1-10.
  • Xie, X., Li, X., Tian, Y., Su, M., Zhang, J., Han, X., Cui, Y., and Bian, S. 2016. Identification and characterization of microRNAs and their targets from expression sequence tags of Ribes nigrum. Canadian Journal of Plant Science 96, 995-1001.
  • Yang, Y., Chen, X., Chen, J., Xu, H., Li, J., and Zhang, Z. 2011). Differential miRNA expression in Rehmannia glutinosaplants subjected to continuous cropping. BMC Plant Biology 11, 1-11.

Yang, Z., Zhu, P., Kang, H., Liu, L., Cao, Q., Sun, J., Dong, T., Zhu, M., Li, Z., and Xu, T. 2020. High-

  • Numnark, S., Mhuantong, W., Ingsriswang, S., and Wichadakul, D. 2012. C-mii: a tool for plant miRNA and target identification. In "BMC genomics", Vol. 13, pp. 1-10. BioMed Central.
  • Padmashree, D., and Ramachandraswamy, N. 2016. Identification and characterization of conserved miRNAs with its targets mRNA in Trichinella Spiralis. Bioinformation 12, 279.
  • Pal, S., Singh, S., Ashutosh, K. S., Madan, M. G., Suman, P. K., and Ajit, K. S. 2011. Comparative withanolide profiles, gene isolation, and differential gene expression in the leaves and roots of Withania somnifera. The Journal of Horticultural Science and Biotechnology 86, 391-397.
  • Pani, A., and Mahapatra, R. K. 2013. Computational identification of microRNAs and their targets in Catharanthus roseus expressed sequence tags. Genomics data 1, 2-6.
  • Saleem, S., Muhammad, G., Hussain, M. A., Altaf, M., and Bukhari, S. N. A. 2020. Withania somnifera: Insights into the phytochemical profile, therapeutic potential, clinical trials, and future prospective. Iranian Journal of Basic Medical Sciences 23, 1501.
  • Saxena, P., Ahlawat, S., Ali, A., Khan, S., and Abdin, M. Z. 2017. Gene expression analysis of the withanolide biosynthetic pathway in hairy root cultures of Withania somnifera elicited with methyl jasmonate and the fungus Piriformospora indica. Symbiosis 71, 143-154.
  • Sewe, S. O., Silva, G., Sicat, P., Seal, S. E., and Visendi, P. 2022. Trimming and validation of illumina short reads using Trimmomatic, Trinity assembly, and assessment of RNA-seq data. In "Plant bioinformatics: Methods and protocols", pp. 211-232. Springer.
  • Sharma, L. K., Madina, B. R., Chaturvedi, P., Sangwan, R. S., and Tuli, R. 2007. Molecular cloning and characterization of one member of 3β-hydroxy sterol glucosyltransferase gene family in Withania somnifera. Archives of biochemistry and biophysics 460, 48-55.
  • Shilpashree, H., Sudharshan, S., Shasany, A. K., and Nagegowda, D. A. 2022. Molecular characterization of three CYP450 genes reveals their role in withanolides formation and defense in Withania somnifera, the Indian Ginseng. Scientific Reports 12, 1602.

Singh, N., Srivastava, S., Shasany, A. K., and Sharma, A. 2016. Identification of miRNAs and their targets involved in the secondary metabolic pathways of

  • Zhou, R., Yu, X., Ottosen, C.-O., Zhang, T., Wu, Z., and Zhao, T. 2020. Unique miRNAs and their targets in tomato leaf responding to combined drought and heat stress. BMC plant biology 20, 1-10.

Zuker, M. 2003. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. Nucleic acids research 31, 3406-3415

  • throughput deep sequencing reveals the important role that microRNAs play in the salt response in sweet potato (Ipomoea batatas ). BMC genomics 21, 1-16.

Zhang, J., Li, Y., Guo, J., Du, B., He, G., Zhang, Y., Chen, R., and Li, J. 2018. Lipid profiles reveal different responses to brown planthopper infestation for pest susceptible and resistant rice plants. Metabolomics 14, 1-13

فایل ها

هم رسانی

ارجاع به این مقاله

آمار